Revisione sistematica degli aspetti inerenti la sicurezza dei prodotti attualmente in uso per la terapia sostitutiva dell’emofilia A: Sicurezza virale e malattia di Creutzfeldt-Jacob (CJD)

di Dr. Vincenzo Speciale Medico-Chirurgo Specialista in Medicina Interna

INTRODUZIONE

La scelta nel trattamento sostitutivo nell’emofilia è databile intorno agli anni ’60 con l’avvento del crioprecipitato, ottenuto dal plasma di una singola donazione per frazionamento successivo a precipitazione a freddo. Tuttavia, il crioprecipitato presentava effetti collaterali indesiderati e non era privo di contaminazioni virali.

Negli anni ’70, sono stati utilizzati nuovi concentrati di Fattore VIII (FVIII) ottenuti da pool di plasma derivati da un gran numero di donazioni.

Nel decennio successivo, grazie all’introduzione del trattamento al calore, grandi progressi sono stati raggiunti allo scopo di inattivare virus potenzialmente contaminanti le donazioni di plasma. In seguito, la realizzazione di metodiche di purificazione sempre più raffinate (cromatografia di esclusione su gel e per immunoaffinità con anticorpi monoclonali), ha fatto progredire il procedimento di preparazione dei concentrati anti-emofilici sino all’ottenimento di preparati estremamente puri cioè con un elevato contenuto di FVIII rispetto al contenuto proteico totale.

E’ bene evidenziare comunque che questi preparati, proprio perchè derivati dal plasma, non possono essere considerati sicuri in assoluto anche se hanno rappresentato una tappa intermedia importante nello sviluppo della terapia più appropriata per i pazienti emofilici.

Come evidenziato dal Registro Nazionale delle Coagulopatie Congenite (Periodo di riferimento: 1991-1993), le cause di morte più frequenti nella popolazione affetta da emofilia A, sono risultate l’AIDS e le complicanze emorragiche.

Il primo decesso per AIDS nella popolazione emofilica è databile già nel 1985, ma è dal 1987 che l’AIDS ha iniziato a costituire una delle principali cause di morte, determinando un significativo aumento della mortalità in questa popolazione. Altra complicanza infettiva post-trasfusionale sono le epatiti virali complicate da cirrosi epatica ed epatocarcinoma. Sulla base dei dati epidemiologici precedentemente citati appare chiaro che il principale obiettivo da perseguire per migliorare la terapia sostitutiva dell’emofilia sia costituito dall’annullamento del rischio di trasmissione delle infezioni virali.

Grazie al recente impiego della tecnologia da DNA ricombinante, già utilizzato con successo per la produzione di farmaci per uso umano, quali l’insulina e l’interferone, è stato possibile ottenere negli anni recenti FVIII da una sorgente non plasmatica e quindi esente da rischi comuni all’impiego del plasma umano.

La produzione di FVIII ricombinante consente potenzialmente di superare l’importante problema legato al fabbisogno di plasma, grazie alla possibilità di produrne in quantità quasi illimitata.

SICUREZZA DEI PRODOTTI PLASMA-DERIVATI

I prodotti plasma-derivati, disponibili per la terapia sostitutiva dell’emofilia presentano alcune limitazioni:

• produzione condizionata dalla disponibilità di plasma, che come è noto, è limitata;
• persistenza del rischio di trasmissione di infezioni virali correlato all’impiego di pool di plasma ottenuto da un gran numero di donatori. Tale rischio tuttora non è scongiurato, nonostante l’applicazione delle metodiche di inattivazione virale fondate sul calore o sull’impiego di miscele di solvente-detergente.

I dati riportati in letteratura relativi alla sicurezza dei prodotti plasma-derivati, dimostrano che l’evoluzione e il miglioramento delle metodiche di inattivazione via via applicate ai concentrati di FVIII plasma-derivati hanno permesso di ridurre, non di annullare il rischio di trasmissione virale (Mannucci, 1990,1993). Attualmente questi prodotti sono da considerarsi sicuri per quanto riguarda il rischio di trasmissione del virus HIV (1-2) e si associano ad un rischio di contaminazione estremamente ridotto da parte di virus dell’epatite B e C (1-3-4).

In questi ultimi anni, tuttavia, sono emerse significative evidenze circa la possibilità di contaminazione dei concentrati di FVIII plasma-derivato da parte di virus privi di involucro lipidico, quali il virus dell’epatite A, il parvovirus B19 ed il TT virus.

Un’epidemia di epatite A, è stata descritta (Mannucci et al. 1994) in emofilici trattati con FVIII plasma-derivato inattivato mediante l’uso di solventi e detergenti che esercitano azione virucidica dissolvendo l’involucro lipidico virale. Tale epidemia è stata poi controllata grazie alla diffusione della vaccinazione per l’epatite A nella popolazione di emofilici a rischio.

Recentemente, un ulteriore progresso è stato raggiunto con l’applicazione delle tecniche di identificazione del genoma virale mediante PCR. L’applicazione della PCR, quale metodica diagnostica per il virus dell’epatire C, è attualmente obbligatoria in Europa e le case produttrici dei prodotti plasma-derivati in distribuzione in Italia, applicano tale test sia su pool totale che su mini pool. Il test PCR è anche adottato per la diagnostica dei virus dell’epatite A,B,HIV e parvovirus B19 da tutte le Aziende, fatta eccezione per Kedrion.

I principali metodi di inattivazione virale, compatibili con il mantenimento dell’attività biologica dei fattori della coagulazione, pertanto applicabili ai concentrati, sono il trattamento al calore secco, la pastorizzazione, il trattamento con solvente-detergente.

Il virus HIV è termolabile mentre i virus epatitici richiedono trattamento prolungati, con temperature più elevate e i virus privi di involucro lipidico (virus dell’epatite A, virus TT, parvovirus B19) sono pertanto difficilmente inattivabili con i metodi correnti.

Negli ultimi anni, sono state messe a punto tecniche di ultrafiltrazione e nanofiltrazione, che consentono di trattenere nelle membrane filtranti, anche virus privi di involucro lipidico e di dimensioni estremamente ridotte ma tali metodiche, sono attualmente applicate solo a concentrati di Fattore IX e XI, essendo tali molecole abbastanza piccole da passare attraverso i filtri.

In conclusione, gli attuali metodi di inattivazione virale sono efficaci nel prevenire la trasmissione di HIV, ed il rischio di infezione è da ritenersi estremamente basso.

Per quanto riguarda il rischio di trasmissione di epatiti, tale evento si è notevolmente ridotto, ma non è ancora stato eliminato. I concentrati sottoposti a riscaldamento a 80° per 72 ore sembrano associarsi ad un rischio assai limitato di trasmissione di virus epatitici. I prodotti trattati con solvente-detergente si dimostrano eccellenti per quanto riguarda i dati di sicurezza per epatite B e C.

Gli studi prospettici di sicurezza condotti sui prodotti pastorizzati indicano un basso rischio di epatite, tuttavia i casi di epatite B e C sono stati riportati in letteratura.

L’infezione da parvovirus B19, può essere del tutto asintomatica, sebbene talvolta possa dare luogo ad anemia ipoplastica, particolarmente in soggetti immunodepressi. L’infezione materna, può determinare idrope fetale. Il metodo di inattivazione virale correntemente in uso (trattamento al calore con solvente-detergente e pastorizzazione) si sono dimostrati inefficaci nel prevenire la trasmissione di questo virus privo di involucro lipidico ed altamente termoresistente (5-6). La persistenza del parvovirus B19 nei concentrati viene inoltre considerata un indice di potenziale contaminazione da eventuali altri virus non ancora identificati.

MALATTIA DI CREUTZFELDT-JAKOB E POSSIBILE RISCHIO DI TRASMISSIONE PER VIA EMATICA.

Recentemente, l’epidemia di encefalopatia spongiforme bovina (BSE) verificatasi a partire dal 1986 nel Regno Unito ed il successivo riscontro di casi anche in altri Paesi dell’ Unione Europea, ha focalizzato l’attenzione dell’opinione pubblica internazionale sulla Malattia di  Creutzfeldt-Jakob (CJD). Si tratta di una malattia neurologica di tipo degenerativo che nell’uomo è rara e ad evoluzione fatale.

La CJD è associata ad un agente trasmissibile, il prione, particella infettiva di natura proteica (glicoproteina), priva di acido nucleico e resistente quindi all’azione degli enzimi che distuggono l’RNA ed il DNA.

La sua struttura ultramicroscopica, è diversa da quella dei virus e pertanto non può essere considerato né un virus né un viroide (cioè una struttura dotata di acido nucleico), né tantomeno un fungo, un batterio od un parassita.

L’isoforma fisiologica della proteina Prionica (PrPC, Prion related Protein), è presente sulla superficie di tutte le cellule nucleate, ma è maggiormente espressa nei neuroni e viene codificata da un gene situato sul braccio corto del cromosoma 20 dell’uomo. Il suo ruolo è sconosciuto, si sa che è una proteina che lega il Rame (Kretzschmar, 1999).

La proteina prionica esiste però in due isoforme (Korth, 1997), che hanno peso molecolare e sequenza aminoacidica identici, ma differiscono nella struttura terziaria e quaternaria: PrPC 0o PrP-sens), isoforma normale, sensibile a detergenti e proteasi, e PrPSc (o PrP-res), isoforma patologica, parzialmente resistente a detergenti e proteasi, che quando viene trattata con queste sostanze dà origine alla PrP27-30.

PrPSc e PrP27-30 sono correlata invariabilmente con la CJD e l’isoforma PrPC presenta un polimorfismo associato specificatamente con alcune CJD.

Si ipotizza che l’isoforma PrPSc trasmetta la sua caratteristica resistenza all’isoforma PrPC, e che questo provochi un accumulo di materiale proteico che causerebbe la malattia (Weber,1997,1999). Questo tipo di modificazione strutturale, da una conformazione prevalentemente alfa-elicoidale ad una forma denominata beta-PrP è stata riprodotta in vitro, e l’attitudine della forma beta-PrP a costituire aggregati fibrillari sembra fornire un plausibile meccanismo molecolare della propagazione del prione. (Wadsworth, 1999).

Si riconoscono forme “familiari” di CJD causate da una mutazione del gene della proteina prionica, forme “sporadiche” la cui causa non appare chiarita e forme “iatrogene” dovute al contatto con materiale infetto. La trasmissione di CJD da un essere umano ad un altro è stata dimostrata sulla base di esposizioni parenterali sia dovute a trapianti di tessuti (come cornea o dura madre), sia a iniezioni periferiche di preparati a base di strumenti chirurgici presumibilmente infetti, specie nel corso di interventi di  neurochirurgia.

Nel 1996, è stata diagnosticata per la prima volta nel Regno Unito una forma di CJD diversa da quelle precedentemente note (insorgenza in età più giovane, evoluzione clinica più lenta, alterazioni neuropatologiche differenti per caratteristiche, ma anch’essa ad evoluzione fatale). Per quanto i livelli di conoscenza siano ancora limitati, appare però con sufficiente certezza che l’agente patogeno di questa nuova forma di Malattia di  Creutzfeldt-Jakob (vCJD) sia la stessa della BSE e che la sua acquisizione sarebbe da correlare all’assunzione di prodotti derivati da bovini affetti da BSE.

La possibilità di trasmissione di BSE nell’uomo con il sangue ed i suoi componenti o derivati non è mai stata dimostrata sperimentalmente (7) né in studi di coorte condotti su soggetti emofilici politrasfusi (8) o in studi caso-controllo (9-10). Recentemente però, è stata confermata la possibilità di trasmettere per via ematica, in un modello animale diverso dai bovini, una malattia simile alla BSE: tale modello sperimentale è stato ritenuto dalla comunità scientifica sufficientemente comparabile alla patogenesi della vCJD nell’uomo (11).

Nonostante il fatto che in passato nessuno dei casi noti di CJD o di vCJD sia stato attribuito a trasfusione di sangue, emocomponenti o plasmaderivati, è aumentata a livello internazionale la preoccupazione per un rischio teorico di contaminazione per via trasfusionale. Agli inizi del 2004 infatti,  è stato documentata la presenza di vCJD in un paziente trasfuso con unità di globuli rossi concentrati ottenuti da donatore che ha poi sviluppato la malattia.

I principali motivi di tale preoccupazione sono da attribuire ai seguenti aspetti (12):

a)    la natura dell’agente della malattia è ancora poco conosciuto, anche se l’ipotesi del prione è la più accreditata;

b)    il prione è resistente alle convenzionali misure di sterilizzazione;

c)    nel passaggio per via ematica da uomo a uomo la “barriera di specie” non risulta efficace;

d)   l’emergere di una variante di malattia (vCJD),potrebbe comportare rischi diversi e più severi, di quelli in precedenza attribuiti alla forma classica;

e)    la considerazione che non sia eticamente accettabile anche la trasmissione di un solo caso di malattia in seguito a terapia trasfusionale.

Si è pertanto posta la necessità di valutare l’opportunità di assumere provvedimenti restrittivi nei confronti dei donatori o nel trattamento del sangue, dei suoi componenti e derivati: tale opportunità viene posta non sulla base di evidenze mediche documentate, ma sulla base di “un principio di precauzione” che nell’ambito dell’Unione Europea è stato codificato, dal punto di vista normativo, solo in riferimento alla protezione dell’ambiente. Tuttavia, in pratica, la sua portata è molto più ampia ed esso trova applicazione in tutti i casi in cui una preliminare valutazione scientifica obiettiva indichi che vi siano ragionevoli motivi di temere che i possibili effetti nocivi sull’ambiente e sulla salute degli esseri umani possano essere incompatibili con il livello di protezione prescelto dalla Comunità.

La Commissione delle Comunità Europee ritiene anche: a) che il principio di precauzione svolga un ruolo importante nella “gestione del rischio”, b) che giudicare quale si il ivello di rischio “accettabile” per la società costituisca una responsabilità eminentemente politica e c) che in taluni casi la risposta giusta possa essere l’inazione o quanto meno la decisione di non adottare misure giuridicamente vincolanti.

Nel caso in cui si ritenga di dover agire, le misure da adottare sul principio di precauzione dovrebbero essere proporzionali rispetto al livello di rischio, coerenti con provvedimenti assunti in situazioni analoghe, basate su un esame dei potenziali vantaggi ed oneri, compresa una analisi costi/benefici e soggette a revisione sulla base di nuove evidenze scientifiche.

L’adozione di provvedimenti restrittivi deve sempre essere una scelta equilibrata tra la necessità di soddisfare il fabbisogno di sangue, emocomponenti e plasmaderivati e la garanzia della sicurezza del prodotto: non sarebbe, infatti, giustificabile una misura che, sulla base di un rischio bassissimo o solo ipotetico, facesse mancare una terapia sicuramente salva-vita.

Si deve considerare che il grande livello di incertezza in merito alla vCJD ha portato gli organismi comunitari europei e l’FDA a concludere che il rischio di trasmettere attraverso il sangue umano la vCJD possa essere più elevato rispetto a quello ipotizzato per la CJD classica.

Ogni argomentazione o campagna informativa deve considerare che il donatore volontario, periodico e non remunerato è motivato alla sua attività sulla base di convincimenti etici, attitudini altruistiche e disponibilità di tipo solidaristico.

Tali atteggiamenti vengono sicuramente minati nel donatore, con la conseguenza di un allontanamento dall’attività di donazione, dalla diffusione di notizie di tipo allarmistico che possono indurre nel donatore il timore non giustificato di provocare nel ricevente una malattia o, addirittura di riceverla egli stesso.

Nel 1997 (13), l’Organizzazione Mondiale della Sanità, aveva raccomandato di escludere dalla donazione di sangue, di tessuti o di organi soggetti con CJD, demenze, soggeti trattati con estratti ipofisari, che avessero ricevuto trapianto di dura madre, nonché soggetti che avessero una storia familiare di CJD.

In considerazione del fatto che la vCJD si è manifestata quasi esclusivamente nel Regno Unito, la residenza in tale paese è stata considerata un fattore di rischio e nel 1999 la FDA ha raccomandato di sospendere indefinitivamente i donatori che avessero soggiornato per un periodo cumulativo di 6 mesi nel Regno Unito tra il 1980 e il 1996. Tale provvedimento, è scaturito da una valutazione statistica ed epidemiologica, secondo la quale si sarebbe in tal modo eliminato il 90% circa delle giornate trascorse dalla popolazione dei donatori in quel Paese, con una perdita del 2,2 di donatori (14).

In Italia, uno studio dell’Istituto Superiore di Sanità, aveva valutato un costo in perdita di donatori, anche superiore e tale misura è stata introdotta nel nostro Paese nel novembre del 2000. Una tale scelta, ancorchè non basata su considerazioni strettamente scientifiche, ma ha un atteggiamento precauzionale, può essere considerata accettabile tra la riduzione ulteriore del rischio di trasmissione di vCJD e l’impatto di una riduzione del numero di donatori sull’autosufficienza.

La FDA, ha inoltre raccomandato dall’aprile 2000, di escludere dalla donazione i soggetti trattati o che possono essere stati trattati con insulina bovina.

Nell’agosto 2000, i competenti organismi del Canada hanno esteso i provvedimenti precauzionali anche a soggetti che hanno risieduto in Francia per 6 mesi nello steso periodo 1980-1996.

Un ulteriore effetto negativo dei criteri di esclusione troppo costrittivi nei confronti dei donatori periodici non è solo il rischio della mancata autosufficienza: i donatori esclusi dovranno essere rimpiazzati da altri nuovi donatori che, specie nelle regioni più carenti, rischiano di aumentare la quota dei cosiddetti donatori occasionali nei quali la prevalenza di marcatori di malattie virali “tradizionali” (HCV,HIV,HBV) e il conseguente rischio di trasmissione con la trasfusione, è sicuramente più elevata.

Uno strumento di selezione accurata del donatore potrebbe essere l’introduzione, da molte parti auspicata, di un test di screening che consenta di individuare la CJD nella sua forma pre-clinica.

Sono in corso numerose valutazioni sperimentali su sangue e tessuti (15): al momento però, non esiste nessun test che possa essere applicato ad uno screening per i donatori, ma deve anche essere considerato che il risultato positivo di un tale test, porrebbe un singolo individuo di fronte alla diagnosi di una malattia fatale e senza nessuna possibilità di previsione del suo tempo di latenza. Tale situazione, comporterebbe gravi problemi anche psicologici per  il donatore che richiederebbero un adeguato supporto e che potrebbero essere un ulteriore elemento di scoraggiamento alla sua attività di donazione.

Trattamento del sangue.

Leucofiltrazione degli emocomponenti.La deleucocitazione delle unità di sangue è un trattamento che si basa su un razionale ampio (riduzione delle reazioni trasfusionali, immunodepressione, trasmissione di virus, ecc.) che costituisce ancora argomento di discussione e di valutazione eterogenee.

Recentemente, alcuni Paesi (Regno Unito, Irlanda, Lussemburgo, Portogallo) hanno introdotto l’obbligo di deleucocitare su tutte le unità prelevate subito dopo la raccolta (pre-storage) come strumento per ridurre il rischio teorico di trasmissione di strutture intracellulari in relazione alla BSE.

I principali motivi che giustificano tale scelta sono i seguenti:

• nei modelli animali sperimentali l’infettività degli agenti responsabili delle malattie tipo BSE è prevalentemente legata ai globuli bianchi che potrebbero fungere da vettori; nella vCJD il sistema linfatico produce le proteine prioniche prima della fase clinica della malattia;
•  la diffusione dell’agente patogeno tra i riceventi e la sua possibilità di “adattamento di specie” potrebbero essere diminuiti. Esistono però alcune perplessità nel considerare i reali benefici della leucofiltrazione in relazione alla BSE.

In particolare:

• non è noto quale debba essere il rischio di trasmissione di agenti patogeni;
• l’efficacia dei filtri per un’adeguata leucodeplezione non è del tutto stabilita e non è chiaro quale tipologia di globuli bianchi sia da considerare il vettore dell’agente della vCJD;
• recenti studi sperimentali non hanno documentato una riduzione della infettività dopo la leucofiltrazione;
• la frammentazione dei leucociti durante la filtrazione potrebbe vanificare il risultato;
• valutazioni sperimentali hanno documentato la presenza dell’agente responsabile di vCJD anche nel plasma, nel crioprecipitato e nei fattori della coagulazione;
• possono verificarsi effetti indesiderati anche con unità leucodeplete;
• alcuni studi su cellule umane dimostrano che l’infettività sarebbe maggiormente correlata alle piastrine piuttosto che ai globuli bianchi.

Per questi motivi, lo Scientific Committee on Medicinal Product and Medical Devices della Commisione Europea (SCMPMD) (16), non ha proposto una chiara raccomandazione di introdurre la leucodeplezione totale degli emocomponenti, anche se ha suggerito che la leucofiltrazione possa essere introdotta come misura precauzionale in quanto può essere ipotizzato un effetto di riduzione dell’eventuale infettività nel sangue e in quanto esistono altri probabili benefici per il ricevente.

Anche la FDA (14) nel giugno 2000 conclude che, nonostante altri potenziali benefici la leucofiltrazione generalizzata non possa essere raccomandata al fine di ridurre il rischio potenziale di trasmissione di CJD e preferisce suggerire una attenta selezione del donatore.

Plasma-derivati.

Ritiro dal mercato. L’organismo britannico preposto (UK Committe on Safety of Medicines), ha disposto di non utilizzare plasma di origine britannica per la produzione di farmaci plasma-derivati. Il SCMPMD europeo e la FDA americana hanno inoltre concordato (17) sulle raccomandazioni in merito al ritiro dal mercato di plasma-derivati provenienti da pool nei quali fosse presente un donatore positivo a CJD:

• se la malattia evidenziata è una forma classica di CJD il ritiro dal mercato dei plasma-derivati non appare giustificato;
• se la malattia è una vCJD viene proposto il ritiro dei farmaci derivati da quel lotto di lavorazione;

Inattivazione della infettività durante la lavorazione.

Studi sperimentali hanno dimostrato una infettività dll’agente della CJD nei leucociti e nelle piastrine, mentre nel plasma è stata osservata nel crioprecipitato e nelle frazioni I,II,III di Cohn, ma non nel IV e V (albumina). E’ stato anche osservato che il trattamento al calore e solvente-detergente per la inattivazione virale non influenzano significativamente la infettività. Sono allo studio altre tecniche quali la nanofiltrazione e la purificazione tramite cromatografia.

Conclusioni.

In considerazione della evidenza clinica delle forme di CJD tutti gli organismi internazionali sottolineano l’importanza di una attenta anamnesi familiare del donatore al fine di escludere in modo selettivo i soggetti che abbiano un riscontro positivo. La scarsa documentazione di efficacia delle altre misure precauzionali, evidenziano l’opportunità di una accurata selezione clinica che ha dato già risultati importanti nella rilevazione di comportamenti a rischio e nella prevenzione di altre malattie trasmissibili. Il provvedimento sospensivo, nei confronti dei soggetti che abbiano soggiornato per più di 6 mesi nel Regno Unito, già adottato in Italia, è conforme alle indicazioni dei principali organismi internazionali.